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分光光度計(jì)介紹

更新時(shí)間:2022-03-29      點(diǎn)擊次數(shù):2131

分光光度計(jì)介紹


簡介

分光光度法是在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度,對該物質(zhì)進(jìn)行定性或定量分析。常用的波長范圍為:(1)200~380nm的紫外光區(qū),(2)380~780nm的可見光區(qū),(3)2.5~25μm(按波數(shù)計(jì)為4000cm<-1>~400cm<-1>)的紅外光區(qū)。所用儀器為紫外分光光度計(jì)、可見光分光光度計(jì)(或比色計(jì))、紅外分光光度計(jì)或原子吸收分光光度計(jì)。為保證測量的精密度和準(zhǔn)確度,所有儀器應(yīng)按照國家計(jì)量檢定規(guī)程或本附錄規(guī)定,定期進(jìn)行校正檢定。

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儀器組成

分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸,蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。

儀器主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統(tǒng)組成。


光譜范圍

包括波長范圍為400~760 nm的可見光區(qū)和波長范圍為200~400 nm的紫外光區(qū)。不同的光源都有其*的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源。

鎢燈的發(fā)射光譜:鎢燈光源所發(fā)出的400~760nm波長的光譜光通過三棱鏡折射后,可得到由紅橙,黃綠,藍(lán)靛,紫組成的連續(xù)色譜;該色譜可作為可見光分光光度計(jì)的光源。

氫燈(或氘燈)的發(fā)射光譜:氫燈能發(fā)出185~400 nm波長的光譜可作為紫外光光度計(jì)的光源。

物質(zhì)的吸收光譜:

如果在光源和棱鏡之間放上某種物質(zhì)的溶液,此時(shí)在屏上所顯示的光譜已不再是光源的光譜,它出現(xiàn)了幾條暗線,即光源發(fā)射光譜中某些波長的光因溶液吸收而消失,這種被溶液吸收后的光譜稱為該溶液的吸收光譜。

不同物質(zhì)的吸收光譜是不同的.因此根據(jù)吸收光譜,可以鑒別溶液中所含的物質(zhì)。

當(dāng)光線通過某種物質(zhì)的溶液時(shí)透過的光的強(qiáng)度減弱,因?yàn)橛幸徊糠止庠谌芤旱谋砻娣瓷浠蚍稚?,一部分光被組成此溶液的物質(zhì)所吸收只有一部分光可透過溶液。

入射光= 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透過光

如果我們用蒸餾水(或組成此溶液的溶劑)作為"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的損失則:

入射光 = 吸收光 + 透過光


原理

分光光度計(jì)采用一個(gè)可以產(chǎn)生多個(gè)波長的光源,通過系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長的光源,光線透過測試的樣品后,部分光線被吸收,計(jì)算樣品的吸光值,從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時(shí),被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比,其關(guān)系如下式:

A=-lg(I/I0)=-lgT=kLc

式中 :A 為吸光度;

I0為入射的單色光強(qiáng)度;

I 為透射的單色光強(qiáng)度;

T 為物質(zhì)的透射率;

k 為摩爾吸收系數(shù);

L 為被分析物質(zhì)的光程,即比色皿的邊長;

c 為物質(zhì)的濃度;

物質(zhì)對光的選擇性吸收波長,以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后可用同樣條件將該供試品配成溶液,測定其吸收度,即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū),除某些物質(zhì)對光有吸收外,很多物質(zhì)本身并沒有吸收但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析。由于顯色時(shí)影響呈色深淺的因素較多,且常使用單色光純度較差的儀器,故測定時(shí)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌吠瑫r(shí)操作。


來源“百科"


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